疏水作用色譜是在高離子強度的條件下，蛋白質溶解度降低，易吸附在中等疏水性的填料表面。隨著離子強度的降低，蛋白質的溶解度增加，逐步從柱子上洗脫下來。該法具有高分辨率及保持蛋白質生物活性的特點。

 

疏水作用色譜的固定相表面為弱疏水性基團，它的疏水性比反相色譜用的固定相低幾十到幾百倍，而流動相為高離子濃度的鹽溶液。蛋白質分子在這樣的固定相和流動相中進行分配，蛋白質分子上的疏水性基團和固定相的疏水基團作用而被保留。當用流動相洗脫時逐漸降低流動相的離子強度，洗脫能力增強。利用被分離組分分子表面的疏水微區、（可逆）變性后暴露出的疏水殘基，或在高鹽環境下暴露于分子表面的疏水殘基與固定相的疏水性 配體之間的作用強弱，依次用從高至低離子強度洗脫液可將疏水作用由弱到強的組分分離開。蛋白質分子按其疏水性大小被依次洗脫出來，疏水性小的先流出。在這樣的高鹽水溶液中，蛋白質不會失活。高濃度鹽與水分子發生強烈作用，導致疏水分子周圍形成空穴的水分子減少，促進疏水性分子與介質的疏水配基之間發生結合。這種疏水作用的大小取決于固定相和溶質的極性、流動相的組成和濃度。由于各種蛋白質表面氨基酸殘基極性不同，因此有可能通過改變固定相的極性和流動相的組成使蛋白質得到分離。

 

疏水層析的原理*不同于離子交換層析或凝膠過濾層析等技術，使該技術與后兩者經常聯合使用來分離復雜的生物樣品。目前該技術主要應用領域是在蛋白質的純化方面，成為血清蛋白、膜結合蛋白、核蛋白、受體、重組蛋白等，以及一些藥物分子，甚至細胞等分離時的有效手段