反相色譜柱是指利用非極性的反相介質(zhì)為固定相，極性有機溶劑的水溶液為流動相，根據(jù)溶質(zhì)極性(疏水性)的差別進行溶質(zhì)分離與純化的洗脫色譜法。與HIC一樣，RPC中溶質(zhì)也通過疏水性相互作用分配于固定相表面，但是，RPC固定相表面*被非極性基團所覆蓋，表現(xiàn)出強烈的疏水性。因此，必須用極性有機溶劑(如甲醇、乙腈等)或其水溶液進行溶質(zhì)的洗脫分離。

　　溶質(zhì)在反相介質(zhì)上的分配系數(shù)取決于溶質(zhì)的疏水性，一般疏水性越大，分配系數(shù)越大。當(dāng)固定相一定時，可以通過調(diào)節(jié)流動相的組成調(diào)整溶質(zhì)的分配系數(shù)。RPC主要應(yīng)用于相對分子質(zhì)量低于5000，特別是1000以下的非極性小分子物質(zhì)的分析和純化，也可以用于蛋白質(zhì)等生物大分子的分析和純化。由于反相介質(zhì)表面為強烈疏水性，并且流動相為低極性的有機溶劑，生物活性大分子在RPC分離過程中容易變性失活，所以，以回收生物活性蛋白質(zhì)為目的時，應(yīng)注意選用適宜的反相介質(zhì)。

　　反相介質(zhì)的商品種類繁多，其中醉具代表性的是以硅膠為載體，通過表面鍵合非極性分子層制備。通過控制反應(yīng)時間和溫度，可獲得性能穩(wěn)定的反相介質(zhì)。在硅膠基質(zhì)的反相填料中，以鍵合有C18、C8、C2的球形多孔填料醉為常見，用途醉廣。

　　RPC固定相大多是硅膠表面鍵合疏水基團，基于樣品中的不同組分和疏水基團之間疏水作用的不同而分離。在生物大分子分離中，多采用離子強度較低的酸性水溶液，添加一定量乙腈、異丙醇或甲醇等與水互溶的有機溶劑作為流動相。