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詳談反相色譜柱的原理

更新時間:2019-09-05瀏覽:5974次
       根據(jù)流動相和固定相相對極性不同,液相色譜分為正相色譜和反相色譜柱。流動相極性大于固定相極性的情況,稱為反相色譜柱。非極性鍵合相色譜可作反相色譜柱。在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用醉廣泛,現(xiàn)代液相色譜分析工作的70%以上是在非極性鍵合固定相上進行的。
  反相色譜柱是指利用非極性的反相介質(zhì)為固定相,極性有機溶劑的水溶液為流動相,根據(jù)溶質(zhì)極性(疏水性)的差別進行溶質(zhì)分離與純化的洗脫色譜法。與HIC一樣,RPC中溶質(zhì)也通過疏水性相互作用分配于固定相表面,但是,RPC固定相表面*被非極性基團所覆蓋,表現(xiàn)出強烈的疏水性。因此,必須用極性有機溶劑(如甲醇、乙腈等)或其水溶液進行溶質(zhì)的洗脫分離。
  溶質(zhì)在反相介質(zhì)上的分配系數(shù)取決于溶質(zhì)的疏水性,一般疏水性越大,分配系數(shù)越大。當(dāng)固定相一定時,可以通過調(diào)節(jié)流動相的組成調(diào)整溶質(zhì)的分配系數(shù)。RPC主要應(yīng)用于相對分子質(zhì)量低于5000,特別是1000以下的非極性小分子物質(zhì)的分析和純化,也可以用于蛋白質(zhì)等生物大分子的分析和純化。由于反相介質(zhì)表面為強烈疏水性,并且流動相為低極性的有機溶劑,生物活性大分子在RPC分離過程中容易變性失活,所以,以回收生物活性蛋白質(zhì)為目的時,應(yīng)注意選用適宜的反相介質(zhì)。
  反相介質(zhì)的商品種類繁多,其中醉具代表性的是以硅膠為載體,通過表面鍵合非極性分子層制備。通過控制反應(yīng)時間和溫度,可獲得性能穩(wěn)定的反相介質(zhì)。在硅膠基質(zhì)的反相填料中,以鍵合有C18、C8、C2的球形多孔填料醉為常見,用途醉廣。
  RPC固定相大多是硅膠表面鍵合疏水基團,基于樣品中的不同組分和疏水基團之間疏水作用的不同而分離。在生物大分子分離中,多采用離子強度較低的酸性水溶液,添加一定量乙腈、異丙醇或甲醇等與水互溶的有機溶劑作為流動相。
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