C4反相色譜柱在經過出廠測試后是保存在乙腈-水中的；由于色譜柱在儲存或運輸過程中固定相可能會干掉，這會引起鍵合相的空間結構發生變化。因此，新的色譜柱在用來分析樣品之前，請一定要充分平衡色譜柱。C4反相色譜柱的平衡方法是：以純乙腈或甲醇作流動相，首先用低流速0.2ml/min將色譜柱平衡過夜（請注意斷開檢測器！），然后，將流速增加到0.8mL/min沖洗30min以便將色譜柱的填料充分平衡至*狀態。平衡過程中，將流速緩慢地提高直到獲得穩定的基線，這樣可以保證色譜柱的使用壽命，并且保證在以后的使用中，獲得分析結果的重現性。請一定確保所使用的流動相和乙腈-水互溶。如果您所使用的流動相中含有緩沖鹽，應注意首先用20倍柱體積的5%的乙腈-水流動相“過渡”，然后使用分析樣品的流動相直至得到穩定的基線。