1. 按照相反的流動方向將色譜柱連接到液相系統上；

2. 不要將色譜柱與檢測器相連；

3. 以推薦zui大流速的一半流速，使用濾過的20%乙醇超純水溶液進行色譜柱的過柱；

注意：反相色譜柱需要使用60%的乙醇。

4. 繼續重復上述程序，直到您確信色譜柱已經再水化處理完畢。再水化處理可能需要

幾個小時的時間，這取決于色譜柱的尺寸大小；

5. 按照正確的流動方向將色譜柱連接到液相系統上；

6. 如果有機物不是正常流動相的一部分的話，要使用3個柱體積的超純水沖洗色譜柱

以去除有機物；

7. 使用上樣緩沖液進行柱平衡（通常使用3——5個柱體積）；

8. 使用QC 測試方法評價柱子的性能，以確保色譜柱能夠正常使用。

除鹽：對普通反相 C18 鍵合相柱，為除去柱中含有的緩沖鹽類或水溶性物質時，不應使用純水沖洗。因為 C18 鍵合相像一條長鏈將硅膠黏結，當有有機溶劑存在時，其表面被流動相潤濕， C18 長鏈*展開，像海水中的海藻一樣。當純水或緩沖溶液通過時， C18 鍵合相不能被浸潤，鍵合相表面會塌陷，從而將溶劑、樣品分子或無機鹽分子包合。此時僅用純水無法將包合物洗脫出，應使用含 5 ％有機溶劑的水溶液沖洗，以清除無機鹽或水溶性物質。

蛋白污染：如果需從硅膠鍵合固定相清洗蛋白質殘留物，必須使用和前述不同的程序。如果生物材料血漿或血清樣品注入色譜柱，在大多數情況下，純有機溶劑 ( 如乙腈或甲醇 ) 并不能溶解肽和蛋白質，用它們清洗色譜柱是無效的。然而，有時使用有機溶劑與緩沖物、酸或離子對試劑的混合物卻是有效的。

由于污染物聚集在色譜柱頭，逆向沖洗會縮短污染物在柱中遷移的距離；又因為色譜柱皆在高于操作壓力下填充的，通常逆向液流不會擾動色譜柱床。但如果色譜柱頂端過濾篩板的孔徑大于柱底部過濾篩板的孔徑，則固定相的微小粒子會在逆向沖洗過程通過篩板流出柱，從而會在柱中產生新的死空間引起柱床松動。因此在逆向沖洗前，應先確認柱管兩端過濾篩板的孔徑一致。